研究内容
通过生物力学测试、组织形态计量学、微型计算机断层扫描和定量反向散射评估愈合和完整的骨骼。通过酶联免疫吸附测定法测定甲状旁腺激素（PTH）血清水平。Cckbr-/-小鼠的骨折愈合不受影响。
然而，Cckbr-/-小鼠在骨愈合过程中显示出来自完整骨骼的钙动员增加，与WT小鼠相比，PTH水平和破骨细胞数量显着升高证实了这一点。在两种基因型中，补钙显着降低了继发性甲状旁腺功能亢进症和完整骨骼中的骨吸收，但在WT小鼠中更有效。
此外，钙给药改善了WT小鼠的骨愈合，表现为骨折愈伤组织的机械性能和骨矿物质密度显着增加，而在Cckbr中没有显着影响-/-老鼠。
因此，在胃酸过少引起的钙吸收不良的情况下，对愈伤组织矿化至关重要的钙似乎越来越多地从完整的骨骼中转移出来，有利于骨折愈合。在骨折愈合期间补钙可防止全身钙动员，从而维持骨量并改善健康个体的骨折愈合，而该效果受到胃酸过少的限制。
研究方法
老鼠
所有实验均根据有关实验动物护理和使用的国际法规进行，并经负责的伦理委员会（第号，RegierungsprsidiumTübingen，德国）批准。26周龄的雌性野生型(WT)小鼠(S6/SvEvTac)获自TaconicFarms,Inc.(TaconicFarmsInc,NY)。相同年龄的雌性Cckbr-/-小鼠由汉堡-埃彭多夫大学医学中心提供。10所有小鼠都被关在最多四只动物的笼子里，并保持14小时光照和10小时黑暗的节奏，随意饮水和食物。直到手术当天，所有小鼠都接受相同的标准饮食，其中含有来自混合缀合物的1%钙（R/MH，V-，SsniffSpezialittenGmbH，Soest，Germany）。手术后，将小鼠随机分为两组，接受标准饮食（S）或定制饮食（C，改良，AltrominSpezialfutterGmbHCo.KG，Lage，德国），额外添加0.8%葡萄糖酸钙（C）。我们选择葡萄糖酸钙补充剂是因为在中性pH值下的溶解度比其他钙结合物更高。
手术程序
所有程序均在使用2%异氟醚(Forene,Abbott,Wiesbaden,Germany)麻醉的小鼠中进行。如前所述，小鼠在右股骨中轴接受标准化截骨术。16-18简而言之，使用线锯（直径0.4mm，RISystem，Davos，Switzerland）创建截骨间隙，并使用外部固定器（轴向刚度3.0N/mm，RISystem）稳定。术前1天至术后3天，在饮用水中给予25mg/L盐酸曲马（Tramal，GruenenthalGmbH，Aachen，Germany）作为镇痛剂。手术前一次皮下注射克林霉素-2-磷酸二氢盐(45mg/kg,Clindamycin,Ratiopharm,Ulm,Germany)用于抗菌。在全身麻醉下使用颈椎脱臼法在10、24或32天处死小鼠。
血清分析
在手术前和处死当天，从面部静脉获得血样。根据制造商的说明（小鼠PTH1-84ELISA试剂盒60-，ImmutopicsInc.，SanClemente，CA），使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定血清PTH浓度。使用酶标仪（InfiniteMNanoQuant，TecanTradingAG，Mnnedorf，Switzerland；SoftwareMagellanVersion6）针对具有规定PTH浓度的标准测定样品的光密度。
生物力学测试
对于完整和截骨股骨的生物力学分析，在第32天将两个股骨移出并通过如前所述的非破坏性三点弯曲试验进行测试。16-18简言之，在移除固定器后，股骨的近端使用双组分粘合剂（i-CemSelf-Adhesive，HeraeusKulzer，Hanau，Germany）固定在铝制圆柱体中。将圆柱体固定在材料试验机（Z10，ZwickRoell，Ulm，Germany）中。股骨髁未固定在远端弯曲支架上。向愈伤组织顶部施加弯曲载荷，最大载荷为4N。抗弯刚度由载荷-位移曲线的线弹性部分计算。
微型计算机断层扫描(CT)分析
在生物力学测试之后，使用CT设备（Skyscan，Kontich，Belgium）以8m的分辨率和50kV和A的电压对股骨进行成像。为了确定骨矿物质密度(BMD)，使用两个具有确定密度的羟基磷灰石（mg/cm3和mg/cm3）的模型进行校准。根据Morgan等人，阈值为mg/cm3。19用于区分矿化组织和非矿化组织。使用μCT分析软件（CTAnalyser，Skyscan），前截骨间隙的区域包括骨膜和骨内愈伤组织被定义为第32天骨折愈合分析的感兴趣体积（VOI），因为我们对骨的最终结果感兴趣康复。根据X射线的标准临床评估，每个愈伤组织的桥接皮质数量在来自μCT分析的两个垂直平面中进行评估。“愈合的骨折”被认为每个愈伤组织有≥3个桥接皮质。在腰椎L3-4中，使用直径为8mm的VOI在第24天检查完整的小梁骨，因为该时间点被认为是完整骨骼中创伤后骨转换的峰值。
组织学
手术后10天对骨折的股骨进行脱钙组织学处理。骨骼在4%福尔马林中固定至少48小时，并使用20%乙二胺四乙酸（pH7.2-7.4）脱钙8-14天。脱水后，将股骨包埋在石蜡中，并用Safranin-O切割7m纵向切片并染色以进行组织定量。在固定器内针孔之间的整个愈伤组织中测定了总骨组织、软骨和纤维组织的相对量，不包括皮质骨。为了在24天后评估完整的小梁骨，腰椎L3-4用于未脱钙组织学。将它们在4%福尔马林中固定至少48小时，并使用增加的乙醇浓度进行脱水。嵌入甲基丙烯酸甲酯后，切割7m切片并用Giemsa染色，以50倍放大倍数在光学显微镜（LeicaDMI，Leica，Heerbrugg，Switzerland；SoftwareMMAFVersion1.4.0MetaMorph，Leica，Switzerland）下计数破骨细胞和成骨细胞的数量。成骨细胞计数的标准是在骨表面的位置、适当的形态和染色。破骨细胞计数的标准是位于骨表面的位置、三个以上的细胞核和适当的形态。每只小鼠分析取自愈伤组织中心的一个切片的每个结果参数。适当的形态和染色。破骨细胞计数的标准是位于骨表面的位置、三个以上的细胞核和适当的形态。每只小鼠分析取自愈伤组织中心的一个切片的每个结果参数。适当的形态和染色。破骨细胞计数的标准是位于骨表面的位置、三个以上的细胞核和适当的形态。每只小鼠分析取自愈伤组织中心的一个切片的每个结果参数。
定量背向散射
定量背散射电子成像（qBEI）用于根据其他方法确定裂缝愈伤组织的矿化程度。20-22简而言之，在第24天，对来自骨折愈伤组织的嵌入甲基丙烯酸甲酯的4-μm纵向切片进行抛光和碳涂层，以确定BMD分布。扫描电子显微镜（LEOVP，LEOElectronMicroscopyLtd.，Cambridge，England）在恒定工作距离（BSE检测器，型，KEDevelopmentsLtd.，Cambridge，England）下以15kV和pA运行，具有一个3微米的像素大小。合成羟基磷灰石样品（DOTMedicalSolutions，Rostock，Germany）用于创建校准曲线并包含不同的Ca/P比率，这些比率由能量色散X射线分析（DX-4，EDAX，Mahwah，NJ）和qBEI确定.生成的灰度值代表平均钙含量（Cameanwt%）。
统计分析
所有图形值都以箱线图的形式呈现，具有中值、最小值、最大值和四分位数范围。异常值（值小于第一个四分位数减去四分位数范围的1.5倍或大于第三个四分位数加上四分位数范围的1.5倍）被标记为圆圈。使用了统计软件IBMSPSSStatistics21(SPSSInc.,Chicago,IL)。如果两个以上的组相互比较，则使用带有Bonferroni校正的Kruskal-Wallis检验分析数据。如果仅将两组相互比较，则使用Mann-WhitneyU-检验来确定统计学意义。表示显着性的水平为p≤0.05。n=5–12。样本量是根据先前关于股骨骨折主要结果参数抗弯刚度的研究计算的（功效80%，α0.05）。18每个实验的样本量在图表中显示。
研究结果
Cckbr-/-小鼠的胃酸过少不会导致骨愈合受损。与WT小鼠相比，骨折愈伤组织的弯曲刚度、总体积、BMD和骨桥没有显着改变（图1A-D）。
此外，qBEI分析表明，新形成的骨中钙的数量和分布不受钙吸收不良的影响（表1）。我们还在较早的时间点（第10天）对骨折愈伤组织进行了组织学分析，以评估软骨内骨形成。Cckbr-/-小鼠在骨和软骨的相对数量方面没有表现出差异，表明软骨形成和软骨-骨转化未受干扰（图1E-G）。
图1(A)野生型(WT)和Cckbr-/-喂食标准死亡(S)或补充钙(C)的小鼠在第32天骨折股骨的弯曲刚度。（B）第32天骨折愈伤组织的总愈伤组织体积（TV）和（C）骨矿物质密度（BMD）。（D）每组未愈合（虚线条）和愈合骨折（阴影条）的百分比。愈合骨折定义为≥3个桥接皮质。(E)10天后骨折愈伤组织中骨组织(TOT)和(F)软骨组织(Cg)的百分比。*对比S，p≤0.05。每个实验的样本量显示在每组下方。(G)WT和Cckbr第10天骨折愈伤组织的代表性图像-/-喂食标准品(S)或补充钙(C)的小鼠死亡。切片用番红O染色以识别软骨（红色）、骨骼（浅蓝色）和纤维组织（紫色）。比例尺：μm。
表1.野生型(WT)和Cckbr-/-小鼠骨折愈伤组织中新形成的骨在骨折后24天的定量反向散射分析
表1Cckbr-/-小鼠骨折后完整骨骼的钙动员增加
为了评估完整骨骼的钙动员，我们首先分析了骨折后10、24和32天的PTH血清水平。与截骨前的值相比，截骨后的PTH水平在WT和Cckbr-/-小鼠中均显着增加（图2A）。在第24天，与WT小鼠相比，Cckbr-/-小鼠显示出显着更高的PTH水平。因为PTH增加破骨细胞活性，我们通过组织形态计量学和μCT分析了未骨折骨的细胞数量和结构参数。
事实上，Cckbr-/-小鼠的椎体中破骨细胞的数量显着增加，而与WT小鼠相比，成骨细胞的数量没有显示出显着差异（图2）C和D)。μCT分析表明椎体的BMD和结构参数没有显着差异（表2）。然而，完整股骨的生物力学测试显示，在第32天，Cckbr-/-小鼠的弯曲刚度略有下降（表2）。
图2(A)野生型(WT)(白条)和Cckbr-/-(深灰色条)小鼠截骨前(d0)和截骨后第10、24和32天喂食后血清中的甲状旁腺激素(PTH)水平与标准饮食(S)。#与相同基因型的d0，p≤0.05。(B)截骨前(d0)和截骨术后第10、24和32天，WT（白条）和Cckbr-/-小鼠（深灰色条）的血清PTH水平，在第0天喂食S并补充钙(三)截骨后。#vs.d0相同基因型,p≤0.05,*vs.重量，p≤0.05。(C)骨折后第24天椎体中每骨周长的破骨细胞数(NOc/BPm)和D)每骨周长的成骨细胞数(NOb/BPm)。*对比WT或Cckbr-/-S，p≤0.05。每个实验的样本量显示在每组下方。(E)骨折后第24天来自椎体L4的代表性微计算机断层扫描图像。
表2.野生型(WT)和Cckbr-/-喂食标准饮食(S)或补充钙的小鼠骨折后第24天完整股骨和L3-L4小梁骨的生物力学和微计算机断层扫描分析(C）
钙补充剂改善了WT的骨愈合，但在Cckbr/小鼠中没有
我们接下来讨论了补钙是否可以改善骨折愈合的问题。钙补充剂对WT小鼠的骨愈合具有积极作用，而Cckbr-/-小鼠的骨折愈合没有显着改变。在第32天补钙后，WT小鼠的股骨骨折显示出显着增加的弯曲刚度和BMD（图1A和C）。骨折愈伤组织中的总愈伤组织体积（图1B）和软骨和骨组织的数量（图1E和F）在第10天没有显示出显着差异。然而，定量反向散射分析表明钙的量显着增加在补充的WT小鼠的新形成的骨骼中，但在补充的Cckbr中没有-/-小鼠（表1）。
补钙可改善Cckbr/小鼠的创伤后钙动员
因为与WT小鼠相比，喂食标准饮食的Cckbr-/-小鼠在骨折愈合期间表现出更高的PTH水平，我们还分析了钙补充后的PTH血清水平。在WT和Cckbr-/-小鼠中，创伤后PTH的强烈增加被钙补充消除（图2B）；与所有时间点（第10、24和32天）的截骨前值相似。PTH减少在WT小鼠中更有效。喂食富含钙的饮食的WT和Cckbr-/-小鼠的椎体骨小梁中破骨细胞和成骨细胞的数量显着减少（图2C和D）。此外，在WT和Cckbr-/-小鼠、BMD、骨体积与组织体积、小梁厚度和小梁数量在补钙后显着增加（表2，图2E）。完整股骨的生物力学测试和μCT分析表明，Cckbr-/-小鼠在截骨后32天降低的完整股骨弯曲刚度被钙补充消除。补充后Cckbr-/-小鼠的皮质厚度显着增加（表2）。
研究讨论
由于胃酸过少患者的患病率越来越高23以及使用PPI治疗的患者骨质疏松性骨折的高发生率，阐明钙吸收不良对骨折愈合的影响具有相当大的临床意义。值得注意的是，迄今为止尚未对此进行研究，尽管人们普遍认为钙对愈伤组织矿化至关重要。只有少数研究表明膳食钙缺乏对骨愈伤组织发育有中等影响。
因此，本研究的目的是调查Cckbr中的骨折愈合情况-/-小鼠，其胃酸水平较低、肠钙吸收受损和骨质疏松骨表型。
值得注意的是，我们发现钙吸收不良不会显着影响Cckbr-/-小鼠的骨折愈合。然而，这些小鼠在骨折后表现出增加的PTH血清水平，这是缺钙的指标，并导致骨吸收增加以恢复生理钙浓度。
因此，我们建议Cckbr-/-与WT小鼠相比，-/-小鼠在骨折后的完整骨骼中显示出增加的钙动员，因为它们的胃钙溶解度受损。完整骨骼中破骨细胞数量显着增加和完整股骨弯曲刚度降低证实了这一假设。
先前在实验和临床研究中都表明，骨折事件可能导致完整骨骼的创伤后钙动员和骨质流失增加，特别是在骨质疏松症或维生素D缺乏的患者中。老年骨折患者的血清PTH水平在骨折后1年仍然升高，表明在初始损伤后的很长一段时间内，来自完整骨骼的钙动员增加。初始骨折后的创伤后骨质流失可能导致临床研究报告的进一步骨折的风险增加三倍。
在本研究中，我们还发现WT小鼠的血清PTH水平显着升高，表明正常标准饮食可能含有不足以用于骨折愈合的可用钙。因此，骨折后WT小鼠的骨骼钙动员也增加，但由于它们正常的胃钙溶解度和吸收，与Cckbr-/-小鼠相比，影响较小。
一种对抗创伤后骨质流失的策略可能是补钙。因此，我们研究了使用葡萄糖酸钙补充钙是否会影响WT和Cckbr-/-小鼠的骨折愈合，葡萄糖酸钙在中性pH下的溶解度比其他钙缀合物更大。已显示长期补充葡萄糖酸钙可逆转Cckbr-/-小鼠的骨质疏松表型。此外，与用标准饮食喂养的小鼠相比，用葡萄糖酸钙喂养4周的Atp4d缺陷小鼠表现出降低的PTH水平和破骨细胞数量。
在本研究中，钙补充剂改善了WT的骨折愈合，但在Cckbr中没有-/-老鼠。在喂食富含钙的饮食的WT小鼠中，骨折愈伤组织中的BMD和钙含量显着增加，导致骨折骨的机械能力增加。
这些结果证实了先前的研究表明，膳食钙补充剂增加了去卵巢大鼠骨折间隙的骨桥接，并且单次高剂量钙注射增加了非去卵巢大鼠骨折胫骨的生物力学特性。此外，补充WT小鼠骨折后PTH血清水平没有增加。这些发现还强调了这样一个假设，即标准饮食中的钙含量可能不足以帮助骨折愈合。补充的小鼠不需要从完整骨骼中调动钙来允许正常的骨折愈合。
此外，完整骨骼中破骨细胞的数量显着减少，导致椎体骨密度、小梁厚度和小梁数量增加。因此，我们的研究提供了证据，表明钙摄入在骨折愈合期间可能对膳食钙摄入量较低的患者产生积极影响，不仅对愈伤组织矿化，而且对非骨折骨骼的BMD也有积极影响。
与我们的预期相反，补充葡萄糖酸钙并没有改善Cckbr-/-小鼠的骨折愈合过程。然而，骨折后增加的PTH水平降低。因此，葡萄糖酸钙补充剂可能导致Cckbr-/-小鼠的胃钙吸收更高，从而改善骨折后完整骨骼的创伤后钙动员。这些小鼠完整骨小梁中破骨细胞数量的减少强调了这一结论。
此外，与Cckbr相比，补充的Cckbr-/-小鼠显示出完整股骨的弯曲刚度和皮质厚度增加，以及椎体中的BMD、小梁厚度和小梁数量增加-/-用标准饮食喂养的小鼠。然而，补充Cckbr-/-小鼠的PTH水平仍显着高于补充WT小鼠，这可以解释为什么Cckbr-/-小鼠的骨折愈合没有改善。
临床数据显示，补充葡萄糖酸钙的胃酸缺乏患者的BMD增加。然而，没有前瞻性研究表明骨折的胃酸或胃酸过少的患者在愈合期间接受了葡萄糖酸钙补充剂的治疗。一项观察性研究显示，一名患有非创伤性前臂骨折并补充葡萄糖酸钙的胃切除患者的完整胫骨中的BMD增加，表明这些患者在骨折后补充葡萄糖酸钙以防止创伤后骨质流失的临床需求强烈。
总之，本研究表明，在胃酸过少引起的钙吸收不良的条件下，愈伤组织矿化所必需的钙越来越多地从完整的骨骼中转移出来，有利于骨折愈合。
创伤后骨质流失可能是初次骨折事件后进一步骨折风险增加的原因。
在骨折愈合期间补钙可以防止全身钙动员，从而保持骨量，甚至改善健康个体的骨折愈合。
在胃酸过少的患者中，重要的是应用足量的在中性pH下具有高溶解度的钙结合物，例如葡萄糖酸钙。
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